培养基的灭菌

培养基灭菌方法很多，生产上多采用蒸汽加热灭菌，操作控制方便、经济效果好。本章只讨论发酵培养基的灭菌。

近年来发展较快，尤其是电子计算机在培养基制备及设备控制中的应用，提高了培养基质量、提高了发酵产品的收得率。

酒精厂的蒸煮和灭菌都起到灭菌作用，但蒸煮与灭菌的目的不同：一般蒸煮温度比灭菌温度低，加热和维持时间要比灭菌时间长得多。

加热温度和时间不仅对原料灭菌和蒸煮有作用，而且对培养基的养分也有破坏作用；既要达到灭菌效果，又须尽量减少养分破坏，故要恰当地掌握加热的温度和时间。

培养液灭菌也可利用化学药物和电磁波杀死微生物；还可用机械方法（过滤、离心分离、静电）除去微生物。但在发酵工业中，大量培养液处理广泛应用蒸汽加热的方法。

微生物受热而破坏是指其生活能力丧失，源于细胞内分子的重新排列的反应。

杂菌是复杂的高分子体系，其受热死灭因蛋白质高分子的活性化、结果导致蛋白质变性，这种反应属于一级反应。

因此一定温度下受热灭活过程与一级化学反应中未反应分子的减少类似——活细胞与未应分子等价，也属于一级反应。

N 表示活菌个数，−dN/dτ 即活菌的减少率，按一级反应：

积分整理得灭菌时间公式：

若要求灭菌后绝对无菌(Nₛ=0)，则由公式可见灭菌时间将等于无穷大，这是不可能的，故培养液灭菌后以在液中残留一定活菌数进行计算。

工程上通常取 Nₛ = 10⁻³ 个/罐，即杂菌污染降低到每 1000 罐中只残留 1 个活菌的程度，已满足生产要求。

反应速度常数 k 表示微生物对热的抵抗能力，也说明死灭难易：k 值愈小则愈耐热。细菌胞子(芽胞)抗热高于营养细胞，芽胞的 k 值比营养细胞和霉菌胞子小得多。

微生物受热被杀死属单分子反应，故灭菌温度与菌死亡反应速度的关系可用阿累尼乌斯(Arrhenius)方程表示：

图2-1：按计算示例求出的不同灭菌温度 T 下的反应速度常数 k 数值——k(min⁻¹) 随 T(℃) 升高而急剧增大。

根据 Eyring 的绝对反应速度理论，热死灭温度与菌死亡反应速度常数 k 的关系为：

可导出湿热灭菌的时间和温度之间的理论关系。但实际灭菌时间与温度还受氢离子浓度、成分、杂菌浓度、杂菌种类等因素影响。

在活化能大的反应中，反应速度常数随温度的变化也大；反之活化能小则随温度变化很小。

所以当提高温度时，杂菌死亡速度的增加远大于养分破坏速度的增加，即杂菌死亡速度比养分破坏速度快得多——这就是高温短时灭菌的理论依据。

培养基灭菌应尽量采用高温短时的连续灭菌。培养基经连续加热、维持和冷却后进入发酵罐。

连续灭菌的优点：

1. 提高产量——相比分批灭菌培养液受热时间短，可缩短发酵罐周期，同时培养基成分破坏较少
2. 产品质量较易控制
3. 蒸汽负荷均衡，锅炉利用率高
4. 适于自动控制
5. 降低劳动强度

料液经连消泵打入连消塔加热灭菌，再到维持罐保温，最后经喷淋冷却器降温去发酵；过程中加消泡剂。

图2-2 部件：1 料液罐　2 连消泵　3 连消塔　4 维持罐　5 喷淋冷却器；另有消泡剂加入、去发酵、冷却水。

套管式连消塔：待灭菌培养液由下部外管圈进入，由内外两管间向上流动；被内管小孔喷出的蒸汽加热到 383–403K。

料液在管间高温灭菌的逗留时间为 15–20s，流动线速度要小于 0.1 m/s。

内管开 45° 斜喷孔、向内开孔、孔距小且渐减，使蒸汽均匀加热。蒸汽喷孔易堵塞，孔径不宜太大，一般为 6mm。

图2-5 部件：蒸汽入口、培养液进、培养液出（内外双管套管结构）。

混合式连消塔：待灭菌培养液由下端进入，加热蒸汽由侧面进入后成环形加热料液。蒸汽喷出口的高度适宜是为防止噪音。

上升的培养液被圆形挡板挡向四周上升，随后又被蒸汽第二次加热。

图2-6 部件：培养液进/出、蒸汽侧入、圆形挡板。

混合式连消器：器身为圆筒，筒下端伸入一套管喷嘴，与底盖连接；喷嘴上方有圆形挡板，用三根支柱焊在套管上。

培养液在圆筒内维持一定时间后由筒顶排出。结构简单、外形尺寸小、使用效果好；该混合式连消器可做成卧式，在工厂中效果也好。

图2-7 部件：培养液进/出、蒸汽进、套管喷嘴、圆形挡板、三根支柱。

维持罐：料液由上部进入，维持灭菌温度一定时间后，去喷淋冷却器。

图2-9 部件：1 人孔　2 进料罐　3 出料罐　4 温度计测温口　5 排尽管；另有料液入口、压力表、排气、去喷淋冷却器。

生培养液 → 喷射加热(蒸汽喷入) → 维持段 → 膨胀阀 → 急速冷却器(真空)。

图2-1-55 流向：生培养液、蒸汽、维持段、膨胀阀、真空、急速冷却器。

喷射加热器：料液经渐缩喷嘴 1 高速喷出时，蒸汽由吸入口 2 进入吸入室 3 进入混合喷嘴 4 中混合；混合段 5 较长，经扩大管 6 把温度能转变为压力能，料液被压入与扩大管 6 相连接的管道中。

图2-8 部件：1 喷嘴　2 吸入口　3 吸入室　4 混合喷嘴　5 混合段　6 扩大管（蒸汽由侧下吸入）。

薄板换热器连续灭菌流程(图2-4)：生培养液经冷却水段预热 → 蒸汽段加热 → 维持段保温灭菌 → 输出灭菌后培养基(含热回收)。